编者导语
首先，很是荣幸的邀请到袁超博士做客“临床质谱网媒体平台” 。为了答谢业内同行的厚爱，我们将会在“专家讲坛”栏目中连续宣布袁老师有关临床质谱的应用、标准品、线性、权重、同位素内标、离子抑制、基质效应等精彩干货内容，以飨读者 。承接上期，本期袁老师为各人带来同位素内标的精彩介绍 。
作者简介
袁超博士
现任美国华人临床化学学会主席，美国大型临床检测实验室质谱实验室主任 。于四川大学获得生物化学学士学位、美国堪萨斯大学获得生物化学博士学位，其后在霍普金斯和伊利诺伊大学做博士后，主要研究偏向为卵白质组和质谱 。袁超博士最近十年主要从事临床质谱要领开发和应用 。
第六节 同位素内标
同位素内标是质谱要领独吞的，没有别的临床检测要领用到同位素内标 。好比光吸收和免疫的要领，都无法区分出被检测物和同位素内标的区别，因为它们的理化性质太接近了 。如果真的加进内标，那测出来的值肯定大大的偏高 。只有质谱才华把同位素内标和要检测的物质分得开，虽然它们的差别只有几个道尔顿 。
有一句古老的谚语叫"你不可能两次趟过同一条河流，因为你第二次过河的时候，河里的水已经跟上一次纷歧样了" 。液相色谱也是一条河，先从溶液瓶流到色谱泵，压力增加后推着样品到色谱柱子，在柱子里实现色谱疏散后，不要的分流到废液，有用的流向质谱，最后在spray里气化、离子化，钻进质谱 。这中间就像弯弯曲曲的河流一样，充满了变数，同一个样品做多遍，每遍获得的最后结果，不管是色谱峰的峰高照旧峰面积，可能会有很大差别 。色谱只是一条河，样品的前期处理又是一条河 。沉淀，离心，稀释，复溶都保存变数 。怎样包管样品里被检测的物质在经过这一条一条的河以后，每次都以差未几的面目飞进质谱呢？内标是一个主要因素 。
现在的内标基本都是稳定同位素标记的，最常见的是氘和碳十三 。内标用在质谱上是上个世纪五六十年代的事儿，那时候这个新技术叫"同位素稀释法" 。这个名字古老的就像"学部委员"一样，现在再没人使用了 。把这个词挂在嘴边的都是些八九十的老头子 。但那时候同位素内标可是个新鲜看法，人们借用了渔民的术语来描述它的用处 。渔民们每年要预计湖里鱼的产量，然后凭据产量来定捕捞量 。怎样精确的定量湖里有几多鱼呢？这个就像怎样准确丈量血液里的分子浓度，总不可跳进去，一条一条的数吧 。如果把湖抽干，然后再数 �？烧庥氤踔臼掠朐肝� 。所以渔民们发明了一个智慧的步伐 。他们先抓一千条鱼，每个鱼的背上做个记号，穿个小铁环，然后把这些做了记号的鱼再放回湖里 。过几天，再捕一千条鱼，然后看这些鱼里面有几多条是有记号的 。然后公式一算，就能估摸出湖里有几多条鱼，带标记的鱼越少，湖里的鱼越多 。把有记号的鱼放回湖里，稀释到宽大的没有记号的鱼群里，这就是"同位素稀释法"名字的由来 。
同位素内标和被检测物是同一个物质，可是其中的几个氢原子被氘所取代，或者是碳十二换成了碳十三，理化性质基本稳定 。即即是背上多了个这么个"金属环"，"鱼"该怎么游照旧怎么游，不管游过几条河，几道弯，始终能代表着没有标记的鱼 。如果河拐弯儿时，丢了几条鱼，那有标记的也会丢几条，最终的比例是大致牢固的 。到了质谱检测的时候，有标记的没标记的分子会被离开来算 。质谱就是一个能检测分子量的精细的秤，几个道尔顿的差别可以分得清清楚楚 。标记了的鱼放一堆儿，没标记的一堆儿 。然后算比例来决定浓度 。如此这样，漂流时所经历的变数都被内标的此消彼消，此长彼长给扯平了 。
所以内标要跟被检测的物质是同一条"鱼" 。不可你要算鲫鱼，却放了背上有环儿的鲶鱼进去 。鲶鱼在湖底里游，不可能代表鲫鱼的行为，测出的数值会有偏差 。但有时候市场上没有带环的鲫鱼卖，只能用别的鱼，如此的要领就不是很牢靠 。其中一个表象就是稀释时测禁绝 。稀释两倍，浓度应该减半，可是用"鲶鱼"的要领浓度纷歧定是一半，可能多，可能少 。这种要领用起来要小心，市场上有卖鲫鱼内标时赶忙换 。
同样是标记，碳十三就比氘要好 。氘好比是一个大铁环，标记上以后游的照旧跟别鱼有些许差别 。过反相色谱柱时，出的峰总是要早一些，因为氘的亲水性比氢要强 。可是氘要比碳十三自制许多 。它是核电站冷却水的副产品，或者说是废物里提出来的，稍加疏散就纯化出氘来了 。绝大大都氘做的内标性能是很好的 。出问题的经常是一些疏水性比较差，保存时间比较短的物质 。出峰的时候跟许多其它物质一起出来，些许的偏差就能引起浓度测禁绝 。氘标记在分子结构上的那边也很有讲究 。有些化学基团，好比羟基，可以和溶液里的氢爆发"氢氘交换"，鱼的环儿丢了，那肯定就测禁绝了 。一个调解方法是把内标放在氘做的溶液里，这样能包管"环儿"在用以前不丢 。加到样品里到上样的时间很短，氢氘交换还来缺乏爆发 。但最好是把氘放到分子结构里禁止易被交换的地方，好比苯环上，这样用起来便当、省心 。
如果氘是个大铁环，碳十三就是个小塑料环了，对鱼的改变可以忽略不计 。可是价钱是碳十三比较贵，还纷歧定每一种碳十三标记的鱼都有 。但近几年碳十三的内标越来越多 。用的人多了，产量大了，价格就下来了 。再说质谱这么灵敏的要领，内标只用一点点，经常是买的一小瓶还没用完呢，已经到保质期了 。用量大的客户往往可以影响供应商 。所谓店大欺客，客大欺店 。需求大了，就可以让店家定制需要的"鱼" 。小店就只能买市面上有的鱼 。又一个例子证明只有大规模才华玩质谱，要不然耗材的本钱太高 。
加几个同位素（环）合适呢？一个两个太少，会被未标记物的同位素峰所滋扰 。临床质谱测的物质一般都在一千个道尔顿以内，加一加二的同位素峰有个百分之一二，但加三的峰基本就看不见了 。所以加三个同位素最好 。氘加到六个会严重影响保存时间，强烈不建议 。碳十三不改变疏水性，加上六七个也无所为 。但加多了，价钱就上去 。
有了合适的同位素内标后，每个样品里要加几多呢？这里没有一个标准的谜底 。内标的浓度不可太高，太高花钱，还抑制没有标记的鱼；也不可太低，太低测出来的variation太大 。我的经验是标准曲线最上端的三分之一，取个好配的整数 。另外一个经验是取病人的浓度的中间值 。把内标配到这个浓度 。这个浓度不是内标自己的浓度，是加到样品里后稀释事后的浓度 。虽然也有例外，有些物质的浓度太低，内标也是那个浓度的话variation太大；或者因为内标断裂爆发的碎片太弱，必须加的过量，才华抵达和未标记物一样的峰强度 。一般这个时候断裂的键正幸亏氘四周，可以丢氢，也可以丢氘 。丢氘的虽然特异性高，可是这样的碎片比较少，信号弱，需要加的量多一些 。最终目标是内标的峰高和正常病人的检测物的峰高差未几 。但实际事情中，内标的浓度有时要大得多 。这种一般是被检测物浓度太低，多加些内标起�；ぷ饔� 。如果样品制备中有丧失（好比被器皿吸附走了），那丧失的大多是内标，被检测物丢的少 。这时候的内标虽然比检测物的浓度高许多，但还没有高到在离子化时抑制别的分子的田地 。
前面涉及了在质谱里碰撞后爆发的碎片的选择 。这是一个很值得讨论的话题 。不是峰最高的碎片就是最好的 。碎片的特异性高更重要 。建要领的时候多开几个通道，包括三到四个碎片，看哪一碎片特异性最好 。做一批不加内标的病人样品，看哪一个内标的碎片最洁净，就选用哪一个 。如果都不错，那就选一个跟未标记物碎片的化学结构式等同的碎片 。最好是这个碎片上也还带的有内标，哪怕只有一个氘，也可和未标记物的碎片疏散开 。这样在质谱的collision cell里做碰撞时，因为碎片相同所爆发的剩余滋扰可以消除 。
内标要尽早的加，最好是加完病人样品立刻加 。能不可先加内标，再加病人样品呢？没有说不可，但这样做总觉得怪怪的 。有时内标还不可加太早，好比要做dialysis的样品，加的早会影响dialysis的平衡 。内标的浓度上面有讨论 。内标的体积最幸亏100微升以上 。太小的体积加起来variation大 。虽然有例外 。如果做卵白沉淀前用了太多的水溶的内标，有机溶剂的体积会很大，操作起来不便当 。如果可能的话，可以把内标直接加到有机溶剂里，这样加内标和沉淀这两步可以变做一步 。加的体积大一些，也好操作，除非内标在有机溶剂里不溶或不稳定 。
每一个病人的样品里加了同样的体积，同样的浓度的内标，可是最后检测出来的内标的峰却不尽一样 。除了一条河无法过两次外，基质效应也是一个重要因素 。后续会有专门章节说一说基质效应 。
声明：本文章来源“临床质谱网”，作者：袁超博士，大发welcome生物已获得临床质谱网和袁超博士授权，如需转载，请联系原作者！
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